質粒純化需要注意的要點有哪些呢?
發表時間：2024-02-29
質粒是小的環狀超螺旋雙鏈 DNA，在宿主細胞内獨立于染色體外自主複制并穩定遺傳，可通過基因工程改造接入外源 DNA 作爲基因載體，轉入宿主細胞。如今，質粒已成爲生物制藥領域中最重要的工具之一，可用于克隆，擴增和表達目的蛋白；也可用于病毒載體和 mRNA 的生産等領域。質粒純化是大多數分子生物學實驗室的常用技術。雖然标準的堿裂解方法已經很成熟，但仍然可能出現令人驚訝的問題。那麽，你知道質粒純化需要注意的要點有哪些呢?一起來探究一下吧！
忽略質粒的拷貝數
同一大腸杆菌母株的質粒産量可能因多種因素而有很大差異。然而，質粒的複制起點将發揮重要作用，因爲它将決定每個大腸杆菌細胞的質粒拷貝數 。因此，根據質粒的拷貝數，可能需要擴大質粒制備規模或進行多次質粒制備，以獲得足夠的質粒DNA供下遊應用使用。
忘記在培養物中添加抗生素
如果忘記在培養物中添加抗生素或添加太少，則可能導緻質粒丢失。确保仔細檢查培養物中抗生素的濃度。
忽略透氣重要性
大腸杆菌培養物通常在瓶中生長，需要适當的通氣才能實現最佳生長。通常需要以 200-250rpm的速度搖動培養物。此外，考慮通過最小培養物與空氣體積比約爲 1:5 來增加培養物通氣，使用棉塞或透氧膜等确保培養物獲得足夠的通氣。
過量培養
另一種情況是越多并不是越好，如果培養生長時間過長會導緻基因組DNA污染。最好在接種後約 12-18 小時處理細胞。
測量OD600
OD600是估算培養物密度的好方法，以便您知道何時處理細胞。由于高光密度無法測量，因此取一份培養物，稀釋十倍并使用标準分光光度計進行測量。培養物已準備好以0.2-0.35的OD600處理十倍稀釋的培養物。
不要超出負載
許多質粒制備試劑盒都附帶有關培養條件的建議。請仔細遵循這些步驟，以确保裂解純化柱不會過載。添加過多的培養物肯定會降低裂解物的質量、堵塞純化柱并降低純化性能。
操作要清柔
正确純化質粒的關鍵之一是将基因組DNA與質粒DNA分離。可以通過移液或渦旋将細菌沉澱重懸于P1緩沖液中。然而，在裂解過程中不能過度混合，因爲您可能會剪切基因組DNA，而基因組DNA會與柱基質結合并污染您的質粒。
忽略裂解時間
有些人可能認爲裂解時間越長越好，然而大腸杆菌的堿裂解時間過長會産生大量非質粒碎片。此外，不同菌株的大腸杆菌對堿裂解的敏感性也不同。最重要的是，裂解時間過長可能會導緻質粒 DNA 變性，從而導緻制備質量差。
完全中和裂解物
添加中和溶液并與裂解液混合後，不要立即進行下一步！中和不完全可能導緻制備質量差。确保多次翻轉試管以确保裂解物完全中和。即使觀察到大的蓬松沉澱物，也需要多一點時間以确保溶液完全混合。
防止細胞碎片雜質
中和步驟後，許多質粒制備物需要離心以将 DNA 與細胞碎片分離，從而澄清裂解物。在此步驟中，重要的是要緩慢進行，并避免将不必要的細胞碎片轉移到下一步，這可能會幹擾結合和/或降低純度。
記得添加酒精
許多質粒制備試劑盒包含使用乙醇的洗滌緩沖液。這些緩沖液通常爲濃縮液，使用前必須用乙醇稀釋。這是一個常見的錯誤，經常被遺忘并導緻準備失敗。另外，不要忘記确保擰緊蓋子以防止乙醇蒸發。
P2加熱緩沖液
下遊轉化問題的一個常見原因是鹽和蛋白質的污染。确保每次純化後測量A 260/A280和A260/A230比率，高于1.8的比率通常被認爲是純淨且不含污染物的。
不要一次處理太多樣品
雖然可以最大限度地提高時間效率，但質粒純化中的某些步驟對時間敏感。不要嘗試一次處理太多樣本，否則某些準備工作可能會放置太久而失效。
不要忘記熱洗脫
如果質粒>10 kb，請考慮使用加熱至50°C的洗脫緩沖液，以提高從柱基質上洗脫的效率。此外，離心前可以将洗脫緩沖液留在柱上5-10分鍾。
以上就是小編總結的質粒純化需要注意的要點，如果你有更多補充請咨詢百奧創新客服！
忽略質粒的拷貝數
同一大腸杆菌母株的質粒産量可能因多種因素而有很大差異。然而，質粒的複制起點将發揮重要作用，因爲它将決定每個大腸杆菌細胞的質粒拷貝數 。因此，根據質粒的拷貝數，可能需要擴大質粒制備規模或進行多次質粒制備，以獲得足夠的質粒DNA供下遊應用使用。
忘記在培養物中添加抗生素
如果忘記在培養物中添加抗生素或添加太少，則可能導緻質粒丢失。确保仔細檢查培養物中抗生素的濃度。
忽略透氣重要性
大腸杆菌培養物通常在瓶中生長，需要适當的通氣才能實現最佳生長。通常需要以 200-250rpm的速度搖動培養物。此外，考慮通過最小培養物與空氣體積比約爲 1:5 來增加培養物通氣，使用棉塞或透氧膜等确保培養物獲得足夠的通氣。
過量培養
另一種情況是越多并不是越好，如果培養生長時間過長會導緻基因組DNA污染。最好在接種後約 12-18 小時處理細胞。
測量OD600
OD600是估算培養物密度的好方法，以便您知道何時處理細胞。由于高光密度無法測量，因此取一份培養物，稀釋十倍并使用标準分光光度計進行測量。培養物已準備好以0.2-0.35的OD600處理十倍稀釋的培養物。
不要超出負載
許多質粒制備試劑盒都附帶有關培養條件的建議。請仔細遵循這些步驟，以确保裂解純化柱不會過載。添加過多的培養物肯定會降低裂解物的質量、堵塞純化柱并降低純化性能。
操作要清柔
正确純化質粒的關鍵之一是将基因組DNA與質粒DNA分離。可以通過移液或渦旋将細菌沉澱重懸于P1緩沖液中。然而，在裂解過程中不能過度混合，因爲您可能會剪切基因組DNA，而基因組DNA會與柱基質結合并污染您的質粒。
忽略裂解時間
有些人可能認爲裂解時間越長越好，然而大腸杆菌的堿裂解時間過長會産生大量非質粒碎片。此外，不同菌株的大腸杆菌對堿裂解的敏感性也不同。最重要的是，裂解時間過長可能會導緻質粒 DNA 變性，從而導緻制備質量差。
完全中和裂解物
添加中和溶液并與裂解液混合後，不要立即進行下一步！中和不完全可能導緻制備質量差。确保多次翻轉試管以确保裂解物完全中和。即使觀察到大的蓬松沉澱物，也需要多一點時間以确保溶液完全混合。
防止細胞碎片雜質
中和步驟後，許多質粒制備物需要離心以将 DNA 與細胞碎片分離，從而澄清裂解物。在此步驟中，重要的是要緩慢進行，并避免将不必要的細胞碎片轉移到下一步，這可能會幹擾結合和/或降低純度。
記得添加酒精
許多質粒制備試劑盒包含使用乙醇的洗滌緩沖液。這些緩沖液通常爲濃縮液，使用前必須用乙醇稀釋。這是一個常見的錯誤，經常被遺忘并導緻準備失敗。另外，不要忘記确保擰緊蓋子以防止乙醇蒸發。
P2加熱緩沖液
下遊轉化問題的一個常見原因是鹽和蛋白質的污染。确保每次純化後測量A 260/A280和A260/A230比率，高于1.8的比率通常被認爲是純淨且不含污染物的。
不要一次處理太多樣品
雖然可以最大限度地提高時間效率，但質粒純化中的某些步驟對時間敏感。不要嘗試一次處理太多樣本，否則某些準備工作可能會放置太久而失效。
不要忘記熱洗脫
如果質粒>10 kb，請考慮使用加熱至50°C的洗脫緩沖液，以提高從柱基質上洗脫的效率。此外，離心前可以将洗脫緩沖液留在柱上5-10分鍾。
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